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介紹免疫沉淀CHIP的實驗步驟
更新時間:2020-12-28 點擊次數(shù):3335次
 
  免疫沉淀CHIP的原理是:在生理狀態(tài)下把細胞內的DNA與蛋白質交聯(lián)在一起,通過超聲或酶處理將染色質切為小片段后,利用抗原抗體的特異性識別反應,將與目的蛋白相結合的DNA片段沉淀下來。染色質免疫沉淀技術一般包括細胞固定,染色質斷裂,染色質免疫沉淀,交聯(lián)反應的逆轉,DNA的純化,以及DNA的鑒定。因為ChIP實驗涉及的步驟多,結果的重復性較低,所以對ChIP實驗過程的每一步都應設計相應的對照,而且對結果的分析也需要有一定的經驗。對于剛剛開始使用ChIP技術的研究人員來說,使用成熟的商品化試劑盒和相關的技術服務會達到事半功倍的效果。
  一、細胞固定
  甲醛能有效的使蛋白質-蛋白質,蛋白質-DNA,蛋白質-RNA交聯(lián),形成生物復合體,防止細胞內組分的重新分布。甲醛的交聯(lián)反應是*可逆的,便于在后續(xù)步驟中對DNA和蛋白質進行分析。交聯(lián)所用的甲醛終濃度為1%,交聯(lián)時間通常為5分鐘到1個小時,具體時間根據(jù)實驗而定。值得注意的是,交聯(lián)時間如果過長,細胞染色質難以用超聲波破碎,影響ChIP結果,而且實驗材料也容易在離心過程中丟失。交聯(lián)時間如果過短,則交聯(lián)不*,產生假陰性。甲醛的交聯(lián)反應可被加入的甘氨酸終止。
  二、染色質斷裂
  交聯(lián)后的染色質可被超聲波或MicrococcalNuclease切成400~600bp的片段(用瓊脂糖凝膠電泳檢測),以便暴露目標蛋白,利于抗體識別。超聲波是使用機械力斷裂染色質,容易引起升溫或產生泡沫,這都會引起蛋白質變性,進而影響ChIP的效率。所以在超聲波斷裂染色質時,要在冰上進行,且要設計時斷時續(xù)的超聲程序,保證低溫。另外,超聲探頭要盡量深入管中,但不接觸管底或側壁,以免產生泡沫??偝晻r間也不要太長,以免蛋白降解。

滬公網安備 31011802001676號

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